什么是HPLC？

高效液相色譜法（HPLC）可用于分離化合物的成分，告訴您混合物中每種化合物的含量，并幫助確定每種化合物是什么。
HPLC 是分析各種有機(jī)化合物的首選技術(shù)。揮發(fā)性化合物（VOC 和 SVOC）通常最好用氣相色譜儀（GC） 或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）進(jìn)行分析，但高效液相色譜法（HPLC）適用于更多種類的混合物，包括非揮發(fā)性或熱不穩(wěn)定分子。它的優(yōu)點(diǎn)包括多功能性、靈敏度和適用于非常復(fù)雜的混合物。

HPLC是如何工作的?

使用高效液相色譜法進(jìn)行分離是基于分析物中不同化合物與流動(dòng)相（洗脫液）和固定相的親和力。樣品中某種成分的分子與填料之間的特殊分子間相互作用實(shí)際上會(huì)導(dǎo)致這些分子被固定相吸收。

與流動(dòng)相相比，與固定相的相互作用越大，與固定相相互作用的時(shí)間就越長，在色譜柱上停留的時(shí)間也就越長，該成分的保留時(shí)間（Rf）也就越長。該技術(shù)的強(qiáng)大之處在于可使用多種流動(dòng)相和固定相來微調(diào)分離效果。

HPLC有哪些不同用途?

高效液相色譜是一種常用且功能強(qiáng)大的色譜技術(shù)，可應(yīng)用于制藥、生物分析、食品和飲料、臨床、法醫(yī)、環(huán)境和藥物開發(fā)實(shí)驗(yàn)室等領(lǐng)域。
例如，在醫(yī)療環(huán)境中，高效液相色譜可用于確定生物材料中的物質(zhì)含量和濃度。這可能包括尿液中的藥物分析或血清中維生素含量的檢測(cè)。

HPLC有哪些不同類型?

正相高效液相色譜法
在正相色譜中，固定相為非極性，流動(dòng)相為極性。這意味著樣品中的任何非極性物質(zhì)都能更快地洗脫出來，因?yàn)樗鼈兣c流動(dòng)相更接近，移動(dòng)速度更快。

反相高效液相色譜法

反相高效液相色譜法與正相色譜法相反。也就是說，極性流動(dòng)相（如水和極性有機(jī)溶劑）與非極性疏水固定相配合使用。
與正相高效液相色譜法相比，反相高效液相色譜法通常更受青睞，因?yàn)槭褂盟鳛槿軇┛上治鑫锏谋Ａ魰r(shí)間因大氣吸水而發(fā)生偏差的危險(xiǎn)。反相高效液相色譜法也被認(rèn)為更加靈活，因?yàn)槭杷潭ㄏ嗫梢耘c疏水、親水、離子和可電離化合物結(jié)合使用，分離出不同的化合物。

等度洗脫與梯度洗脫

等度洗脫是指在流動(dòng)相中保持恒定的梯度，而梯度洗脫是指在實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相的濃度發(fā)生變化。
與等度洗脫相比，梯度洗脫有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗苁拐麄€(gè)色譜圖中寬度相似的色譜峰間距更加均勻。在等度洗脫過程中，色譜峰的分辨率通常會(huì)降低，在洗脫過程的開始階段，色譜峰之間的距離會(huì)非常近，而在洗脫過程的最后階段，色譜峰之間的距離會(huì)變得更寬。梯度洗脫還能縮短運(yùn)行時(shí)間。
不過，等度洗脫通常比梯度洗脫更受青睞，因?yàn)樘荻认疵撨^程需要操作人員更加細(xì)心和規(guī)范。等度洗脫所需的專業(yè)色譜設(shè)備也較少。

純水對(duì)高效液相色譜有何影響?

高效液相色譜非常依賴于水的純度。使用不純的水源制備洗脫液、空白樣、樣品和標(biāo)準(zhǔn)品可能會(huì)在實(shí)驗(yàn)中引入污染，影響分辨率、整合度和基線，從而降低色譜性能。由于水是 HPLC 中用量最大的試劑，因此所選水的純度必須符合應(yīng)用靈敏度的要求。

你應(yīng)該使用哪種類型的水?

對(duì)于應(yīng)用靈敏度一般的 HPLC 實(shí)驗(yàn)，我們建議使用 II⁺ 型水。如果應(yīng)用的靈敏度較高，則應(yīng)使用 I⁺ 超純水，因?yàn)樗碾娮杪蚀笥?span> 18 MΩ.cm，TOC 值小于 2ppb，細(xì)菌小于 1 CFU/mL，內(nèi)毒素小于 0.03。

儀器儀表

泵:
如果 HPLC 是梯度系統(tǒng)，則可采用低壓梯度 (LPG) 或高壓梯度 (HPG) 流程。在 HPG 中，溶劑在排出側(cè)混合，并從單個(gè)泵輸入。而在 LPG 中，溶劑在吸入側(cè)混合。

色譜柱:
色譜柱是所有 HPLC 系統(tǒng)的核心，因?yàn)樗?fù)責(zé)分離樣品化合物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，有多種不同的 HPLC 柱可供選擇。例如，色譜柱可填充各種不同的填料，以支持各種類型的 HPLC，如反相或正相。

檢測(cè)器:
檢測(cè)器測(cè)量從色譜柱洗脫的每種物質(zhì)的時(shí)間和數(shù)量。檢測(cè)器記錄整個(gè)過程中的成分差異，并將其轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，從而繪制色譜圖。

色譜參數(shù)：

在整個(gè)色譜過程中，檢測(cè)器產(chǎn)生的電子信號(hào)可通過配套的計(jì)算機(jī)轉(zhuǎn)化為色譜圖。這些圖表可用于確定樣品中存在的物質(zhì)及其數(shù)量。每個(gè)信號(hào)峰都代表了流動(dòng)相通過色譜柱的分析物。
從這些峰值中可以獲得各種定性信息，從峰值出現(xiàn)的時(shí)間到物質(zhì)的濃度（以圖表下的面積表示）。
同樣重要的是要考慮過程的分辨率。兩個(gè)峰之間的分辨率值達(dá)到或超過 1.5 意味著樣品成分的分離程度達(dá)到了可以準(zhǔn)確測(cè)量峰的高度和寬度的程度。分辨率可通過基本分辨率方程計(jì)算得出。
該方程中考慮的 HPLC 參數(shù)包括效率因子 (N)、保留因子 (kappa prime) 和分離因子 (α)。然后可以進(jìn)行調(diào)整，如改變實(shí)驗(yàn)中使用的溶劑或改變溫度，以改變這些參數(shù)并提高實(shí)驗(yàn)的分辨率。

提供的水純化系統(tǒng)

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